一、实验原理
根据Burnet的抗体选择学说,一个B淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系称为克隆。来自克隆系的细胞基因是完全相同的,产生的抗体也完全相同。这种从一株克隆系产生的性质相同的均一抗体称为单克隆抗体。但这种具有分泌功能的B淋巴细胞难以在体外长期存活。
利用细胞融合技术,将上述B淋巴细胞与在体外能长期增殖的骨髓瘤细胞进行融合,经过选择培养获取杂交细胞,这种细胞称为杂交瘤细胞(Hybridoma)。该细胞既有免疫B淋巴细胞分泌特异性mAb的功能,又具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力。故应用杂交瘤细胞生产单克隆抗体。
二、仪器设备材料
超净工作台、二氧化碳恒温培养箱、倒置生物显微镜、离心机、恒温水浴箱、冰箱、细胞混匀器、荧光显微镜或流式细胞仪等。培养器皿及其它:96孔、24孔培养板、培养瓶、离心管、平皿、保温杯、培养液过滤装置、不锈钢网及手术剪刀、镊子等。Balb/c小鼠。SP2/0细胞(骨髓瘤细胞)。
三、主要试剂
(1)胎牛血清或小牛血清
(2)培养基:细胞融合常用的培养液有DMEM、RPMI 1640 及无血清培养基等。DMEM有高糖(4500mg/L)及低糖(1000mg/L)之分。杂交瘤细胞在上述几种培养基中均能良好的生长与增殖
(3)HAT及HT培养液:HAT、HT(sigma)以五十分之一的比例加入培养基( DMEM或RPMI 1640)
(4)聚乙二醇(PEG)溶液:称取一定量的PEG,高压蒸汽灭菌(8磅30分钟),待其冷至50℃左右,与等体积的RPMI1640混合,即为50%的PEG溶液,封口后4℃放置备用。用于细胞融合的PEG的分子量可在1000-6000之间,目前已有商品化的50%PEG溶液(美国 sigma 公司)可直接用于细胞融合
四、实验步骤
1. DMEM或1640基础培养基、PEG溶液置于37℃水浴中预温;
2. 将Balb/c小鼠摘眼球处死后,浸入75%洒精;
3. 无菌取免疫小鼠的脾脏;
4. 脾脏用PBS洗涤后,放入无菌过滤的网筛,再把网筛放在盛有完全培养基的玻璃平皿中用研磨棒(或注射器针管)轻轻研磨或挤压,使其通过网筛;
5. 将培养皿中的细胞悬液吸出,放入离心管中,1200rpm/min,离心5min;
6. 收集2×10^7个生长良好的SP2/0细胞,与1×10^8个脾脏细胞混合于透明塑料离心管中;
7. 用RPMI1640洗涤混合细胞两遍,1000rpm离心8min后,弃尽上清并用手指弹击管底,使两种细胞充分混匀成糊状;
8. 将塑料管置于37℃保温杯中,吸取1ml经37℃预温的50%的PEG溶液,将吸管轻轻插入细胞底部,在1min内匀速加完,且边加边轻轻搅拌;
9. 在水浴中静置90s,再加入40ml 37℃预温的DMEM基础培养基,室温静止5min后离心(1000rpm×10min),弃去上清;
10. 将沉淀细胞轻轻用40ml含1%HAT、15%FCS的DMEM培养悬浮。混匀后滴加在上述含有滋养细胞的96孔培养板中,100µl/孔,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;
11. 3~4d后半量换液,10d后改用HT培养基培养,2周后转用含15%FCS(胎牛血清)的DMEM培养基培养。
12. 培养结束后,显微镜观察融合细胞。
五、注意事项
1、整个制备过程需严格无菌及温度控制。
2、细胞传代培养时注意适时更换培养液。
3、SP2/0细胞与脾细胞比例需严格控制,这决定了融合率。
4、融合细胞因细胞膜受损而特别脆弱,操作过程需温和小心。
5、融合剂PEG的加入时间需准确把握,避免融合失败。
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