一、实验原理

根据Burnet的抗体选择学说，一个B淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系称为克隆。来自克隆系的细胞基因是完全相同的，产生的抗体也完全相同。这种从一株克隆系产生的性质相同的均一抗体称为单克隆抗体。但这种具有分泌功能的B淋巴细胞难以在体外长期存活。

利用细胞融合技术，将上述B淋巴细胞与在体外能长期增殖的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞（Hybridoma）。该细胞既有免疫B淋巴细胞分泌特异性mAb的功能，又具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力。故应用杂交瘤细胞生产单克隆抗体。

二、仪器设备材料

超净工作台、二氧化碳恒温培养箱、倒置生物显微镜、离心机、恒温水浴箱、冰箱、细胞混匀器、荧光显微镜或流式细胞仪等。培养器皿及其它：96孔、24孔培养板、培养瓶、离心管、平皿、保温杯、培养液过滤装置、不锈钢网及手术剪刀、镊子等。Balb/c小鼠。SP2/0细胞（骨髓瘤细胞）。

三、主要试剂

（1）胎牛血清或小牛血清

（2）培养基：细胞融合常用的培养液有DMEM、RPMI 1640 及无血清培养基等。DMEM有高糖（4500mg／L）及低糖（1000mg／L）之分。杂交瘤细胞在上述几种培养基中均能良好的生长与增殖

（3）HAT及HT培养液：HAT、HT（sigma）以五十分之一的比例加入培养基（ DMEM或RPMI 1640）

（４）聚乙二醇（PEG）溶液：称取一定量的PEG，高压蒸汽灭菌（8磅30分钟），待其冷至50℃左右，与等体积的RPMI1640混合，即为50%的PEG溶液，封口后4℃放置备用。用于细胞融合的PEG的分子量可在1000－6000之间，目前已有商品化的50%PEG溶液（美国 sigma 公司）可直接用于细胞融合

四、实验步骤

1. DMEM或1640基础培养基、PEG溶液置于37℃水浴中预温；

2. 将Balb/c小鼠摘眼球处死后，浸入75%洒精；

3. 无菌取免疫小鼠的脾脏；

4. 脾脏用PBS洗涤后，放入无菌过滤的网筛，再把网筛放在盛有完全培养基的玻璃平皿中用研磨棒（或注射器针管）轻轻研磨或挤压，使其通过网筛；

5. 将培养皿中的细胞悬液吸出，放入离心管中，1200rpm/min，离心5min；

6. 收集2×10^7个生长良好的SP2/0细胞，与1×10^8个脾脏细胞混合于透明塑料离心管中；

7. 用RPMI1640洗涤混合细胞两遍，1000rpm离心8min后，弃尽上清并用手指弹击管底，使两种细胞充分混匀成糊状；

8. 将塑料管置于37℃保温杯中，吸取1ml经37℃预温的50%的PEG溶液，将吸管轻轻插入细胞底部，在1min内匀速加完，且边加边轻轻搅拌；

9. 在水浴中静置90s，再加入40ml 37℃预温的DMEM基础培养基，室温静止5min后离心（1000rpm×10min），弃去上清；

10. 将沉淀细胞轻轻用40ml含1%HAT、15%FCS的DMEM培养悬浮。混匀后滴加在上述含有滋养细胞的96孔培养板中，100µl/孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；

11. 3~4d后半量换液，10d后改用HT培养基培养，2周后转用含15%FCS（胎牛血清）的DMEM培养基培养。

12. 培养结束后，显微镜观察融合细胞。

五、注意事项

1、整个制备过程需严格无菌及温度控制。

2、细胞传代培养时注意适时更换培养液。

3、SP2/0细胞与脾细胞比例需严格控制，这决定了融合率。

4、融合细胞因细胞膜受损而特别脆弱，操作过程需温和小心。

5、融合剂PEG的加入时间需准确把握，避免融合失败。

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