在不附加任何保护剂下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在﹣130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞冻存时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，待复苏时重新进入生长分裂周期。

实验开始前，将冻存管、15 毫升离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30 分钟。采用通风机通风 3 分钟。以 75%酒精擦拭操作台和双手。准备好冰盒。

将离心机调节至 800 转，5 分钟。水浴箱调节至 37 度恒温。取细胞完全培养基、DMSO、胰蛋白酶等，放于水浴箱中预热。

首先消毒双手和超净台。取约 10ml细胞完全培养基放于 15 毫升离心管中。

配置细胞冻存液：冻存液应该提前配制，置于室温备用，防止临时配制产生的热量损伤细胞，按无血清培养基 比 血清 比 DMSO=7:2:1 的比例配置细胞冻存液，其中加大冻存液中血清的比例对于保存某些脆弱的干细胞以及一些比较珍贵的细胞很有好处的。

按比例加好冻存液组分后，轻轻吸打混匀，置于室温下待用。

从细胞培养箱中取出细胞，进行瓶口消毒，弃去细胞原来的培养基。按每 25cm²/ml胰酶/EDTA 消化液比例加入消化液，放入显微镜下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入2ml细胞完全培养基以立即终止消化。

采用无菌枪头轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有细胞悬液放入一干净的15毫升离心管内。

配平离心：采用天平配平两端，每分钟 800 转，室温离心 5 分钟。

采用罗氏 CASY-DT 快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。加入 10ml CASY-ton至以标记 viable 的管子中，加入 100µl 细胞悬液，颠倒混匀三次，可进行细胞计数。可见每毫升悬液中有活细胞总数。

取出冻存管，注明细胞名称、代数、日期。

离心后，以无菌吸管吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。将细胞沉淀与冻存液充分混匀，根据计数结果，将细胞总数调节至细胞数量为每毫升有 5×10⁵为宜。

将细胞冻存悬液分装入细胞冻存管中，一般一个两毫升冻存管装入 1 至 1.5 毫升细胞冻存悬液为宜。

严密封口后，进行程序性降温冻存：

首先 ﹣4 ℃ 30 分钟，20 ℃ 30 分钟，﹣80 ℃过夜，最后进行液氮保存。

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