根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等等，其中双抗夹心法最为常见。

双抗体夹心法：

①：抗体包被 在96孔板上包被抗体。由于酶标板是由聚苯乙/烯制成，其含有的苯环与抗体的氨基酸残基具有类似π-π堆积作用的引力，结合静电和疏水作用，可以将抗体吸附于其表面。然后，将未吸附的抗体用缓冲液清洗后，加入含有明胶或牛血清蛋白的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分。加入封闭液的目的，是防止其他蛋白因静电或疏水作用吸附在96孔板上，造成假阳性信号，干扰后续实验的进行。

②：免疫识别 在96孔板上包被抗体后，加入待测样，并在37°C环境下孵育一段时间，通常是1-2小时。此时酶标板上的抗体与待测抗原进行特异性识别结合。此处抗体的质量是关键，好的抗体既能特异性高效地结合抗原又不受待测样中其他生物大分子、蛋白质和无机盐等成分的影响。

③：洗板 将未结合的抗原洗掉，加入该抗原所对应的识别抗体并在37°C下继续培养1-2小时，接着将未连接上抗原的抗体洗掉。

④：酶标信号输出 加入带有辣根过氧化酶标记的酶标二抗，用于和标准抗体结合。在培养30分钟后洗掉未连接的二抗，并加入显色剂显色。根据显色的结果判断抗原的浓度。一般认为，抗原浓度与显色后的发光强度呈正相关。

免疫竞争法

以抗原竞争抗体为例，在上述免疫夹心法操作步骤的第二步加入待测抗原后，立刻加入酶标抗原，使之与待测抗原竞争识别酶标板上的抗体。当待测抗原浓度越高，能够连上酶标板上抗体的酶标抗体就越少，输出的信号就越少。这样待测样浓度与酶显色信号就呈逆相关。

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