1、固相载体选择

聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。

聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。

2、包被

①板孔的选择：ELISA级别的微孔板

②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度

③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液

④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h

⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。

3、封闭

①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）

②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）

4、加样及孵育

①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm；

③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示；

④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性

⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染

5、显色和终止

①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明

②显色底物需现配现用，避免污染

③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可

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