ELISA检测试剂盒中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA试剂盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并留意不行溅起，不行发作气泡。
       
加标本一般用微量加样器，按规则的量参加板孔中。每次加标本应更换吸嘴，避免发作交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法 ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规则的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中参加稀释液，再在其中参加血清标本，然后在微型震动器上震动1分钟以保 证混和。加酶结合物使用液和底物使用液时可用定量多道加液器，使加液进程迅速完结。
 
在ELISA检测试剂盒中一般有两次抗原抗体反响，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反响的完结需要有一定的温度和时刻，这一保温进程称为温育（incubation），有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。     

ELISA属固相，抗原、抗体的结合只在固相表面上发作。以抗体包被的夹心法为例，参加板孔中的标本，其中的抗原并不是都有平等的和固相抗结合的时机，只要贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体触摸。这是一个逐渐平衡的进程，因而需经分散，才干到达反响的结尾。在这以后参加的酶符号抗体与固相抗原的结合也同样如此。这便是为什么ELISA反响总是需要一定时刻的温育。

温育常采用的温度有43℃、37℃、室温文4℃（冰箱温度）等。37℃是试验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的适宜温度。在建立ELISA方法作反响动力学研究时，试验表明，两次抗原抗体反响一般在37℃经1-2小时，ELISA检测试剂盒产物的生成可达高峰。为加速反响，可进步反响的温度。

有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反响4℃更为完全，在放射免疫测定中多使反响在冰箱中，以构成多的沉积。但因所需时刻太长，在ELISA中一般不予采用。