免疫组化原理
免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后用HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过与DAB显色剂反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。
免疫组化更多的意义在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western来实现。

免疫组化染色和HE染色的不同之处可能是HE染色比较粗略地辨认不同细胞形态学改变；而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变（数量）、也可检测细胞内细胞因子的转位，组织中一些特异性蛋白的表达的量改变（通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析）。
通俗的讲，HE仅仅是看大体病理改变，比如组织坏死，比如炎性渗出。免疫组化，看你的目的蛋白的表达情况。

免疫组化和HE染色的对比
DAB和HE一样也是一种染色剂，HE染色相对简单，能分辨出细胞中的嗜酸嗜碱性物质；DAB染色全称应该叫做免疫组化DAB染色，经过一系列复杂的生化反应后，DAB(二氨基联苯胺)染色剂能将辣根过氧化物酶染成棕色。

常用的免疫组化染色方法:
组化用HRP的话，信号不够强。通常用生物素标记HRP来增强信号。
1、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法）
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力特性，与生物素化二抗结合，形成抗原＋特异性抗体＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP复合物，最后DAB显色。
复合物配制：先将生物素与酶结合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物。
2、SP法（抗生物素蛋白链酶素-过氧化物酶复合物）
本身没有连接生物素，但有两个生物素亲和力极高的结合位点，可以与二抗上的生物素结合，敏感性高，复合物不需要使用前混合，更为简便。
3、PAP法
4、直接法

样本制备


免疫组化结果分析
免疫组化结果的判断原则：
1、必须设阳性对照和阴性对照。
2、 抗原表达必须在特定部位。
3、 阴性结果不能视为抗原不表达。

免疫组化染色实验组与对照组结果分析表 

从表可以看出只有6、7实验结果有意义。1-5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用Ab。

染色失败的几种情况及原因:
1、所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。
2、所有切片均呈阳性反应。
3、所有切片背景过深。
4、阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

所有切片呈阳性反应，其原因:
1、切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。
2、缓冲液配置中未加氯化纳和PH值不准确， 洗涤不彻底。
3、使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反 应时间过长。
4、抗体温育的时间过长。
5、H₂O₂浓度过高，呈色速度过快且粘附剂太厚。

所有切片背景过深，其原因:
1、内源性过氧化酶没有完全阻断。
2、切片或涂片过厚。
3、漂洗不够。
4、底物呈色反应过久。
5、蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
6、使用全血清抗体稀释不够。

阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。
最常见的原因:标本固定和处理不当。

注意事项：
1、苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。
2、切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片。
3、以下原因可能导致片子着色不均匀：
①脱蜡不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鲜的二甲苯中。
②水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇。
③抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂。④抗体孵育时，切片放倾斜。
⑤抗体孵育后PBS冲洗不充分。
⑥制片厚薄不均匀等问题。
⑦染片盒不平，切片倾斜。
4、一抗的清洗:
1、单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
2、温柔冲洗，防止切片的脱落，推荐用浸洗方式。
3、冲洗的时间要足够，才能彻底洗去 结合的物质。
5、PBS的PH和离子强度的使用：
1、建议PH在7.4-7.6浓度是0.01 M。
2、中性及弱硷性条件（PH7-8）有利 于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利 于分解。
6、拍照：
1、有条件的话应该立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。
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